冰毒检测试纸(胶体金法)的生产合成

冰毒检测试纸(胶体金法)的生产合成

结果:成功制备了直径约20 nm颗粒均一的胶体金,进一步制备了高质量的胶体金标记抗甲基苯丙胺复合物。结论:制备的胶体金标记抗甲基苯丙胺复合物活性较好,能用于检测甲基苯丙胺的胶体金试纸条。

甲基苯丙胺,俗称冰毒,属于苯丙胺类兴奋剂,最早由日本人发明。因其能产生短暂即逝的强烈快感或兴奋,逐步取代了流行的鸦片海洛因大麻可卡因等而成为21世纪全球范围滥用最为广泛的毒品[1],过量食入会形成药物依赖性并造成神经毒性[2],引发社会治安问题,加强对甲基苯丙胺毒品滥用控制和检测刻不容缓。胶体金试纸条检测法,因其简便、快速而成为了小分子化学物质初筛检测的主流[3],该法适合于检测吸毒人员尿液中甲基苯丙胺的存在,胶体金标记抗甲基苯丙胺复合物的质量决定了该法的灵敏度。本实验合成高质量的胶体金标记抗甲基苯丙胺复合物,以应用于能检测吸毒人员尿液中是否含有甲基苯丙胺的胶体金试纸条,现将结果报告如下。

1 材料

四氯金酸,上海国药集团;柠檬酸三钠,广东光华;抗甲基苯丙胺单克隆抗体,甲基苯丙胺- BSA,购自广州优抗多生物技术有限公司:其它试剂均为分析纯。透射电镜,荷兰飞利浦T ech nai;紫外可见光分光光度计,日本岛津:85 -2控温磁力搅拌器,江苏恒丰;酶标仪,英国热电雷勃;台式高速冷冻离心机,Heal Force Neofuge23R。

2方法

2.1 胶体金的制备[4]

取洁净的250ml三角瓶1个,加入100 ml三蒸水和lml 1%的氯金酸,加热至沸腾,再加入1.6ml 1%柠檬酸三钠溶液,磁力搅拌反应15min。溶液的颜色首先变黑,接着变蓝,最后变成酒红色。溶液冷却至室温后,加入0. 02%(m/v)叠氮钠,4。C保存备用。

2.2胶体金与抗体偶联最佳pH值的测定

取5个1.5m1离心管,分别加入700μl胶体金;用25mM K2CO3和0.1M NaAc将pH值分别调为6.0,7.0,8.0,9.0,10.0;按pH从低到高将上述胶体金分别取100 w加入酶标孔中;每孔分别加入3μl抗甲基苯丙胺单克隆抗体f lmg/ml),混匀,室温下放置10—15min;每孔分别加入20 w浓度为10% NaCl溶液,混匀,室温下放置10min;观察胶体金颜色变化,记录保持红色的最低pH值;观察胶体金颜色变化直到室温下放置2h,记录仍保持红色的最低pH值。

2.3抗体最小浓度的测定

用2mM硼酸Buffer稀释抗甲基苯丙胺单抗至0.2mg/ml。按表1梯度稀释:分别取10μl单抗加到100 μl已调至pH 8.5的胶体金中,混匀,室温放置15min;每孔加入20 w10% NaC1,混匀,室温下放置10min;观察(可借助OD570帮助判断)并确定仍能保持红色的最小抗体浓度;实际标记时一般以最小抗体浓度的110%~130%作为标记浓度。

表1 抗甲基苯丙胺单抗的梯度稀释

试管号 1  2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

抗甲基苯丙胺单抗(μl) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

硼酸Buffer(μl)0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

2.4胶体金与抗甲基苯丙胺单抗的偶联[5]

取50ml胶体金,调pH值至8.5,室温磁力搅拌下,缓慢滴加525 μg抗甲基苯丙胺单抗,继续搅拌反应30min;室温磁力搅拌下,缓慢加入5.7ml 10% BSA,继续搅拌反应10mln;离心(13,000 rpm,35min,4。C),弃上清;用BBS(0. 002mol/L,pH 7.4;含5%(w/v)蔗糖,1% (w/v) BSA和0. 02% (w /v)叠氮钠重悬沉淀,重复离心一次;用BBS重悬沉淀,40C保存备用。

3结果

3.1 胶体金的表征

取3ml胶体金,在400—700 nm波长范围内对其进行可见光光谱扫描,扫描结果:所制备的胶体金在520 nm左右有最大吸收峰f胶体金的特征吸收峰),由此可以初步说明成功制备了胶体金。所制备的胶体金颗粒,圆形,均一,直径约20 nm(图略)。

3.2 胶体金与抗体偶联最佳pH的确定

通过观察,当pH 6.0时,颜色浅红;当pH 7.0、pH 8.0,颜色酒红;而当pH 9.0时,颜色又开始变成浅红。偶联实验中选择了pH 8.5。

3.3标记用最小抗体浓度的确定

按照表1梯度稀释抗体,当抗甲基苯丙胺单抗的浓度被稀释至低于0. 08mg/ml(每100 w胶体金中含0.8ug抗甲基苯丙胺单抗)时,OD570开始变大,肉眼观察可以看到胶体金的颜色有些变紫。在实际标记过程中,我们选择它的1.3倍用量也即每100 μl胶体金中添加1.04Ug抗甲基苯丙胺单抗。

3.4胶体金标记抗甲基苯丙胺复合物的鉴定

胶体金被标记后,将制得的复合物在400—700 nm范围内进行光谱扫描,扫描结果:胶体金标记抗体后,相比于未标记,其最大吸收峰发生了红移,由此初步说明纳米金成功标记上抗体,直径增加。

间接ELISA对合成的复合物进行活性测定时,当复合物的浓度被稀释400倍后,OD值仍可达约1.0,显示合成的复合物活性较好。

4讨论

胶体金质量对复合物的合成至关重要。制备胶体金的方法很多,柠檬酸三钠还原法操作相对简单,但反应过程中需把握几个关键点:反应用的器皿要相当洁净(通常先用强酸浸泡再充分漂洗);反应用水需是超纯水:加热要均匀:加入柠檬酸三钠要迅速,否则,纳米金颗粒的形成就会不均一,可能具有不同的大小及形状(如椭圆形、三角形、长方形、菱形等)。这样的颗粒在与蛋白质的结合过程中将无法被均匀包被,也不能在溶液中均匀分布,最终将影响产品的颜色、敏感性、特异性及稳定性。柠檬酸三钠的量影响金颗粒的大小,颗粒太大会给蛋白质的结合产生造成过大的空间位阻,习惯上选择20—40 nm的颗粒。

胶体金颗粒对蛋白的吸附作用取决于pH值[6],这是因为蛋白的净电荷取决于溶液的pH值,在pH= pl时为中性。由于在pH= pl时蛋白溶解度最小,因此,这时它水化程度最小,最容易吸附到疏水的金粒子表面。在实际标记过程中,我们通过测试选择一个最佳的标记pH值。

标记用的抗体不宜太多,这样不但会造成宝贵抗体的浪费,而且会产生过多非特异性吸附,降低该法的灵敏度。标记过程中,还需加入一定量的BSA,否则,合成的复合物容易吸聚产生沉淀。

多数情况下,抗体的Fc结合到纳米金颗粒上,但有时,抗体的Fab会结合到纳米金颗粒上,此时标记后的探针则失去了活性。因此,标记后一定要对其活性进行检测。下一步工作,我们试图将其应用于试纸条的组装,以开发能真正检测吸毒人员尿液中甲基苯丙胺的胶体金试纸条。

参考文献:

[1]陈燕忠,刘安华,刘晓云,等.甲基苯丙胺与蛋白偶联物的合成[J].现代食品科技,2008,24(5):405 - 408.

[2]亓 佳,杨静玉,王芳,等.甲基苯丙胺神经毒性成瘾机制及其滥用防治研究进展[J].沈阳药科大学学报,2008, 25:17 - 22.

[3]林彤,独军政,丛国正,等.胶体金标记免疫层析技术的最新应用进展[J].安徽农业科学,2010,38( 16):8429 - 8431.

[4]杨玉新,叶 阳,周有祥,等.4种化学还原法制备胶体金的比较研究[J].湖北农业科学,201 1,50(3):476 -478.

[5]宋宏新,邹联柱,李 韵,等.纳米胶体金的制备及其抗体标记研究[J].食品科技,2011,36(3):249 - 252.

[6] Couble P. Principles of probe preparation for in situ hy-bridization [M]. Boca Ratront: CRC Press. 1993. 45 -